A tecnologia do DNA recombinante, ou engenharia genética, projectou o mundo da investigação biológica para além dos limites da bioquímica tradicional, permitindo estudar a expressão génica ao nível mais fundamental e levando a que rapidamente esta tecnologia fosse explorada para obtenção de indivíduos melhorados, de novos produtos, ou de vias mais económicas de obtenção de valor acrescentado.
A capacidade inerente à engenharia genética é tal que abrange todos os domínios das ciências da vida, tornando fundamental para os cientistas, conhecê-la e compreendê-la. A abordagem desta tecnologia engloba aspectos mais fundamentais como clonagem génica, produção de bibliotecas, mapeamento e expressão proteica, mas também áreas mais aplicadas como transformação genética, expressão proteica in vitro, ou mutagénese. Pela sua complexidade e actual importância económica, a engenharia genética de plantas é, nesta disciplina, alvo de particular atenção, embora outros organismos sejam igualmente referidos.
O principal objectivo da disciplina de Engenharia Genética consiste na familiarização dos estudantes de Biologia com a metodologia, terminologia e aplicações do DNA recombinante, através da aprendizagem de técnicas, dos seus fundamentos e potencial, e através da apreciação de exemplos concretos que permitam compreender o enorme impacto desta tecnologia em áreas tão diversas como a medicina, a agricultura e pescas e a indústria.

Clonagem molecular: significado e objectivos. Isolamento, purificação, quantificação e detecção de ácidos nucleicos. Enzimologia do DNA recombinante. Etapas da clonagem molecular. Construção da molécula de DNA recombinante. Vectores de clonagem em E. coli. Vectores shuttle. Supervectores. Selecção do sistema hospedeiro – vector. Sistemas de introdução de DNA recombinante em células hospedeiras. Selecção e identificação de clones recombinantes. Estratégias de clonagem - bibliotecas genómicas e bibliotecas de cDNA.
Vectores de expressão em E. coli. Fusões transcricionais e fusões traducionais. Proteínas de fusão – adição de tags e de sinais de secreção. Vantagens e desvantagens da expressão heteróloga em E. coli.
Vectores de clonagem e expressão em células eucarióticas. Sistemas de expressão em levedura e células de mamífero.
Análise dos genes e dos seus produtos. Técnicas de análise de DNA, RNA e proteínas, in vitro e in vivo. Genómica estrutural e funcional.

A engenharia genética (EG) no contexto da biotecnologia vegetal. Caracterização molecular de plantas e sua utilização na pesquisa de genes de interesse. Vectores naturais de transformação de plantas. Vias para a manipulação genética mediada por Agrobacterium, e métodos alternativos de transformação – vantagens e desvantagens. Regeneração e análise de plantas transformadas. Hibridação somática. Algumas técnicas de estudo e de isolamento de genes de plantas ou de controlo da sua expressão. A EG na manipulação do metabolismo e na resistência às doenças: resistência/tolerância a factores de stress (biótico e abiótico); melhoramento da qualidade da planta; a planta como fábrica de produtos importantes. EG de outros organismos (animais, fungos). A EG e a sociedade (legislação, ética, opinião pública).

Clonagem da região reguladora de um gene num vector de expressão:
Digestão de vectores de fusão traducional e de DNA dador com enzimas de restrição e electroforese em gel de agarose.
Purificação de fragmentos de DNA dador.
Preparação de reacções de ligação dos DNAs vector e dador.
Preparação de meio selectivo.
Preparação de células competentes da estirpe hospedeira e transformação pelo método de CaCl2.
Análise e interpretação dos resultados de transformação.
Isolamento de DNA plasmídico pelo método de fervura.
Análise e interpretação dos resultados de sequenciação manual e automática de clones recombinantes.
Resolução de problemas de engenharia genética.
Culturas bacterianas - sua utilização e manutenção (armazenamento, transferência de plasmídios).
Produção de raízes transgénicas por A. rhizogenes.
Obtenção de plantas transgénicas por transformação mediada por Agrobacterium; regeneração de rebentos transformados e análise dos transgenes.
Extracção de DNA de bactérias (lise alcalina) e plantas (mini-CTAB) para análise de PCR.
Isolamento e purificação de protoplastos vegetais. Transformação de protoplastos por permeabilização química ou eléctrica. Análise da expressão temporária do gene transferido para os protoplastos.

Geral
- Nicholl, D.S.T. (2002). An Introduction to Genetic Engineering, 2nd edition. Cambridge University Press.
- Galun E. e Breiman A. (1997). Transgenic Plants. Imperial College Press, London.

Complementar
- Greene, J.J. e Rao, V.B. (1998). Recombinant DNA. Principles and Methodologies. Marcel Dekker, Inc., New York.
- Rapley, R. e Walker, J.M. (1999). Molecular Biomethods Handbook. Human Press, New Jersey.

Componente Prática
Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
Sebenta.
Protocolos.
Catálogos científicos.

AVALIAÇÃO (2007-08)

A avaliação será realizada por meio de um exame escrito, final, compreendendo questões sobre a matéria da teórica e da prática. Este exame, contabilizará 80% da nota final, sendo os restantes 20% o resultado da avaliação do resumo (preparado segundo as normas fornecidas) e do seminário. Haverá avaliações parciais sendo a primeira parte efectuada no Sábado dia 12 de Abril. A segunda data para avaliação parcial será conjunta com a primeira chamada de avaliação global.

DATAS DE AVALIAÇÃO
Exames (globais) a marcar pela secretaria do DBV.
Entrega dos resumos – Até ao dia 29 de Maio 2008.
Apresentação dos seminários – No dia 7 de Junho 2008 (9h -13h).
(Nota - A repetição de um exame na recorrência não obriga à repetição do resumo e do seminário, a menos que nestes tenha sido obtida classificação negativa.)