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Fundamentos de Engenharia Genética
Basics in Genetic Engeneering
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| código |
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| Departamento |
DBV |
| Prof Responsável |
Rita Zilhão |
| Posição em cursos |
Mestrado em Biologia Molecular e Genética, 1º ano, 2 º sem, Opcional |
| Créditos |
3 ECTS
Carga horária semanal (14 semanas úteis de aulas): 1,5 h Teóricas + 0.5 h Orientação Tutorial |
| Pré-requisitos recomendados |
Disciplinas de 1º ciclo na área da Biologia Molecular |
| Objectivos |
A engenharia genética, projectou o mundo da investigação biológica para além dos limites da bioquímica tradicional, pois aplica os conhecimentos mais fundamentais da expressão génica, à criação e expanão de tecnologias que permitem obter de indivíduos melhorados, aumento de produção e desenvolvimento de novos produtos.
A engenharia genética abrange diversos domínios das ciências da vida, tornando fundamental para os cientistas, conhecê-la e compreendê-la. A abordagem desta tecnologia engloba aspectos fundamentais como clonagem de genes e a respectiva análise da dos seus produtos, técnicas de amplificação e de determinação da sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos, mutagénese, edição de genomas etc.. Pela sua complexidade e actual importância económica, a engenharia genética de plantas é, nesta disciplina, alvo de particular atenção, embora outros organismos sejam igualmente referidos.
Esta disciplina é dirigida aos alunos do mestrado em Biologia Molecular e Genética que nunca tiveram formação teórica ou prática nesta área do conhecimento. Pretende-se transmitir os fundamentos das principais metodologias utilizadas em engenharia genética, através da apreciação de exemplos concretos que permitam compreender o enorme impacto desta tecnologia em áreas tão diversas como a medicina, a agricultura e a indústria. Desta forma familiarizam-se com a terminologia e entendem o potencial desta tecnologia e as suas diversas aplicações. Genetic engineering has expanded the world of biological sciences beyond the limits of conventional biochemistry, enabling studies of gene expression at its most fundamental level and making possible its quick exploitation to obtain improved organisms, new products, or more economical means to obtain added value. The power of genetic engineering is such that it covers several domains across life sciences. It has therefore become crucial for scientists to know and understand it. The study of this technology comprises more fundamental aspects such as gene cloning and analysis of their products, nucleic acids amplification and nucleotide sequence determination, mutagenesis, genome editing, etc. Because of its complexity and present economical importance, plant genetic engineering is, in this discipline, object of particular attention, although other organisms are also studied. The main goal of the Genetic Engineering course is to make Biology students become acquainted with the methodology, terminology, and applications of recombinant DNA. This implies learning techniques, their principles and potentials, as well as understanding specific examples, through which they may understand the huge impact of this technology in areas as diverse as medicine, agriculture, and industry.
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| Programa Teórico - Tópicos |
1. Bases moleculares da engenharia genética
2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento, e quantificação
3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral
4. Clonagem de expressão
5. Técnica de PCR
6. Hibridação de ácidos nucleicos
7. Análise dos genes clonados e dos seus produtos
8. Técnicas de mutagénese e editing de genomas in vitro
9. Aplicações da engenharia genética
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| Programa Teórico - detalhes |
Engenharia Genética geral
1. Bases moleculares da engenharia genética
O que é a engenharia genética. As bases moleculares da engenharia genética: o fluxo da informação genética; a expressão génica e a sua regulação; a estrutura do DNA e do RNA; a estrutura dos genes em procariotas e em eucariotas; a dimensão, complexidade e organização genética dos genomas; o transcritoma e o proteoma.
2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento e quantificação
Breve resumo histórico do desenvolvimento da clonagem molecular. Noção de clonagem molecular e de clone molecular. Enzimologia do DNA recombinante. Enzimas de restrição. Enzimas de restrição de tipo II. Mapa de restrição. Importância dos sistemas de restrição/modificação em clonagem molecular. Isoesquizómeros. Enzimas de modificação: nucleases, polimerases, fosfatases e cinases. DNA ligases. Fundamento de alguns processos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos. Métodos de quantificação dos ácidos nucleicos baseados na espectrofotometria e em matrizes (agarose e poliacrilamida) sujeitas a electroforese.
3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral
Clonagem molecular: significado, objectivos e etapas. O papel dos ácidos nucleicos na clonagem molecular. Tipo de hospedeiros: hospedeiros procarióticos e principais hospedeiros eucarióticos (células animais e vegetais, linhas celulares, culturas primárias e tecidos).
Construção de moléculas de DNA recombinante. Preparação de DNA vector e DNA dador. Métodos de produção de fragmentos de DNA e de modificação de extremidades (DNA polimerases, fosfatases de DNA, transferase terminal; adição de linkers e adaptadores). Estratégias de ligação de DNA vector e DNA dador (ligases de DNA). Clonagem dirigida e clonagem não dirigida. Características fundamentais dos vectores de clonagem. Plasmídios, fagos, cosmídios, e fagemídios para clonagem em Escherichia coli. Análise das construções de moléculas de DNA recombinante. Tecnologia de clonagem gateway. Vectores shuttle. Vectores utilizados em células eucarióticas. Cromossomas artificiais: PACs, BACs e YACs. Construção de bibliotecas genómicas. Noção e importância do estabelecimento de contigs. Clonagem a partir de mRNA. Síntese de cDNA. Construção de bibliotecas de cDNA.
Sistemas de introdução de DNA em células procarióticas e eucarióticas. Transformação e transfecção. O empacotamento de vírus de DNA in vitro. Características das células hospedeiras de E. coli. Selecção e identificação de clones recombinantes: a -complementação e a utilização de substratos cromogénicos, a inactivação funcional, a complementação de mutações definidas.
4. Clonagem de expressão
Sistemas de expressão homóloga e heteróloga de genes. Vantagens e desvantagens da expressão heteróloga em E. coli. Expressão citoplasmática e expressão periplasmática ou secreção extracelular. Corpos de inclusão. Configuração de vectores procarióticos de expressão. Fusões transcricionais e fusões traducionais. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Tags e genes repórter. Produção de proteínas recombinantes em E. coli e em leveduras. Colunas de afinidade. Sistemas de detecção e purificação de proteínas. Vantagens da expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Vectores eucarióticos de expressão: plasmídios e vectores derivados de vírus. Marcas eucarióticas de selecção de clones recombinantes. Sistemas e estratégias de clonagem de expressão. Promotores constitutivos e indutivos. Expressão transiente e expressão permanente. Sistemas de expressão génica induzível e condicional. Sistema tet-on/tet-off e sistema cre-lox.
5. Técnica de PCR
História do PCR. Princípios da técnica de PCR convencional e análise dos seus produtos. Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR. A escolha dos primers. Estratégias de clonagem de produtos de PCR. Variantes da técnica de PCR e suas aplicações: a síntese de cDNA e a RT-PCR, Nested-PCR, sistema ARMS, DOP-PCR e PCR multiplex. Técnicas de mutagénese dirigida baseada em PCR (PCR invertido e SOE-PCR (Splicing by overlapping extension). Selecção e identificação de mutantes. A utilidade do PCR em protocolos de screening.
6. Hibridação de ácidos nucleicos
Origem e caracterização das sondas de hibridação de ácidos nucleicos. Sistemas de marcação: marcação radioactiva e não-radioactiva de DNA. Marcação de DNA por nick translation. Marcação de DNA por primers aleatórios. Marcação de extremidades 5’ e 3’ do DNA. Sondas homólogas, heterólogas e degeneradas. Condições de hibridação. Temperatura de fusão/desnaturação (Tm – melting temperature). Sondas de DNA e de RNA (ribossondas). Hibridação dot-blot.
7. Análise dos genes clonados e dos seus produtos
Fundamento das técnicas de análise de DNA e suas aplicações: Técnica de sequenciação do DNA pelo método dos terminadores de cadeia. Sequenciação automática. Hibridação Southern. Detecção de interacções DNA/proteína: técnica de retardação em gel (EMSA – electrophoretic mobility shift assay), técnica de footprinting (DNase I) e imunoprecipitação da cromatina (ChIP).
Fundamento das técnicas de análise de RNA e suas aplicações: Extracção de purificação do RNA. Electroforese de RNAs. Hibridação Northern. Nuclease protection assays (nuclease S1). Mapeamento das extremidades 5' do mRNA por extensão de primer (transcritase reversa). Transcrição in vitro (RNA polimerase). Hibridação in situ.
Fundamento das técnicas de análise de proteínas e suas aplicações: Preparação de extractos proteínas. Electroforese de proteínas (SDS-PAGE) e electroforese bidimensional (2-D PAGE). Imunodetecção por Western blot. Sistemas de tradução e sistemas acoplados de transcrição/tradução in vitro. Sistema do duplo híbrido para detecção de interacções proteicas. Técnica de imunoprecipitação e técnica de pull-down.
8. Técnicas de mutagénese e editing de genomas in vitro
Técnicas e aplicações da mutagénese dirigida. Selecção e identificação de mutantes. Técnicas e aplicações da modificação de genomas baseadas na recombinação.
9. Aplicações da engenharia genética
As aplicações a seguir descritas serão transmitidas durante o curso aquando da explicação das diferentes metodologias.
a) A engenharia genética e a biotecnologia na produção de proteínas e enzimas. A engenharia de proteínas. Produtos terapêuticos utilizados em saúde pública.
b) Aplicações médicas e forenses da manipulação génica. Diagnóstico de doenças transmitidas geneticamente e diagnóstico de infecções. ‘Genetic fingerprinting’ e o perfil de DNA na tipificação molecular de indivíduos. A terapia génica e o seu futuro. RNA de interferência (RNAi) como ferramenta para estudar a expressão génica e com potencial na terapia génica. Molecular cloning: meaning and objectives. Isolation, purification, quantification and detection of nucleic acids. Enzimology of recombinant DNA. The steps of molecular cloning. Construction of the recombinant DNA molecule. E. coli cloning vectors. Shuttle vectors. Selection of the host – vector system. DNA delivery methods into host cells. Selection and identification of recombinant clones. Cloning strategies – genomic libraries and cDNA libraries. E. coli expression vectors. Transcriptional fusions and translational fusions. Fusion proteins – adding tags and secretion signals. Advantages and disadvantages of heterologous expression in E. coli. Vectors for cloning and expression in eucaryotic cells. Yeasts and mammalian cells expression systems. Analysis of genes and their products. Techniques for analysing DNA, RNA and proteins, in vitro and in vivo. Structural and functional genomics.
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| Literatura aconselhada |
Correia MC, Zilhão R. 2011. Manual de Problemas de Engenharia Genética. Associação de Estudantes, FCUL.
Glick, B.R., Pasternack J.J. e Patten C.L. 2009. Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA, 4rd edition. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C..
Nicholl, D.S.T. 2008. An Introduction to Genetic Engineering, 3rd edition. Cambridge University Press.
Videira A. 2011. Engenharia genética: princípios e aplicações. 2nd ed. Lidel, Lisboa.
OUTROS:
Artigos científicos e apontamentos / sebenta sobre o conteúdo programático da disciplina.
Teacher notes and scientific articles
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| Avaliação |
A avaliação será realizada por meio de um exame escrito, final, compreendendo questões sobre a matéria da teórica.
Students evaluation is by a final written exam which covers theoretical material.
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Pautas |
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Topo Porta entrada Mestrados |
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